微生物长期以来一直吸引着研究人员，因为它们具有生产具有多种工业应用的酶的潜力。从新菌株中高效生产蛋白酶至关重要，因为这些酶在分解蛋白质键方面起着至关重要的作用，使其能够在工业应用中使用。因此，本研究从土耳其伊斯坦布尔分离到一株新的Exiguobacterium indicum 1.2.3，并对其进行了鉴定。该菌株产生碱性丝氨酸蛋白酶，以酪蛋白为特定底物，在较低温度(20-40°C)下工作。蛋白酶在30℃下完全稳定3h。该酶在8 ~ 11的pH范围内具有较高的稳定性。pH值为10时活性最佳。Ca2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+在1 mM范围内，粗酶活性分别保持147%、125%、124%和117%。粗酶对苯基甲基磺酰氟无活性，表明活性侧有丝氨酸残基。该酶在表面活性剂和氧化剂的作用下表现出明显的蛋白水解作用。添加Tween 80、Triton X-100和过硼酸钠后，酶活性分别提高了135%、109%和105%。根据洗涤结果，粗酶在30°C下有效地去除了不同类型的标准预染色纺织品上的血液。综上所述，indicum Exiguobacterium 1.2.3是一个很有前途的蛋白酶生产候选者，其应用范围涵盖各个工业领域，特别是洗涤剂。

　　

　　Exiguobacterium属最早由Collins等人(1983)发现，是一种革兰氏阳性、不产孢、兼性需氧、嗜碱和橙色的细菌(Chen等人，2017)。这些细菌群是从土壤、沉积物、海水、永久冻土、冰川、工业废物和热液喷口中分离出来的。该细菌家族包括25个属，可在各种环境条件下生存(D. Zhang et al. 2021)。这种细菌的一个独特特征是它能够产生一种非常稳定的蛋白酶，这种蛋白酶可以在很宽的温度和pH值范围内工作。这种蛋白酶因其催化各种反应的潜力而引起了生物技术行业的关注。

　　工业酶是从微生物中获得的，而不是从动物或植物中获得的酶。微生物酶具有高活性、易修饰能力、不需要中间产物、高稳定性和廉价生产的特点(Raveendran et al. 2018)。因此，微生物快速生产酶的潜力使这类生物在满足工业需求方面占据首位。此外，鉴定出能够生产更具生物技术价值和效率的酶的生物的可能性鼓励研究人员寻找新的产酶微生物菌株(Ben Bacha et al. 2018)。例如，在大量由芽孢杆菌合成的酶中，蛋白酶因其不同的工业用途而具有至关重要的意义;值得注意的是，枯草菌素被用作家用洗涤剂的添加剂(Degering et al. 2010)。

　　另一方面，大肠杆菌是一种以蛋白酶分泌而闻名的细菌，通常用于科学研究和生物技术生产。它通过血红素结合蛋白促进血红蛋白的分解(Otto et al. 1998)。

　　细菌蛋白酶由于其胞外性质和高产率而广泛存在。然而，它们的有效性受到各种物理化学因素的限制，如高温和极端pH下的酶不稳定性、有机溶剂、阴离子表面活性剂、氧化剂的存在以及对辅助因子的需求(Olajuyigbe和Falade 2014)。先前的研究已经确定，该细菌分离物属于Exiguobacterium indicum spp.在单一碳氮源下产生最多的蛋白酶(Hakim et al. 2018)。此外，Exiguobacterium sp .已被证实具有降解和代谢作用。这些结果有力地证明了Exiguobacterium属的成员可以利用和代谢来自环境的各种蛋白质和多糖(Zhang et al. 2021)。

　　自1914年以来，含酶的洗涤剂添加剂被广泛使用(Emon et al. 2020)。碱性蛋白酶是洗涤剂的主要酶，它们与不同组分的组合可以提高洗涤效果。碱性蛋白酶是一种在中性至碱性pH范围内高度活跃的内肽酶。它也被称为丝氨酸蛋白酶(Zhang et al. 2023)。

　　目前，有很多人关注于鉴定能在很宽的温度范围内有效起作用的碱性蛋白酶(Oberoi et al. 2001)。

　　洗涤剂的洗涤效果可以随蛋白酶的变化而变化。即使在氧化剂和漂白剂的存在下，洗涤剂酶也必须保持稳定性。不幸的是，市场上的许多酶都不能满足这一基本要求。探索微生物多样性对于发现具有大量商业应用的新型酶具有巨大潜力(Y. Zhang et al. 2023)。

　　在文献中，很少有关于以肠出iguobacterium indicum为基础的蛋白酶的研究(Emon et al. 2020;Hakim et al. 2018;Kumar et al. 2018)。然而，它具有特殊的蛋白酶特性。本研究旨在确定从伊斯坦布尔环境土壤样品中分离到的一株新菌株indicum Exiguobacterium 1.2.3 (E. indicum 1.2.3)的胞外蛋白酶生产能力、稳定性和洗涤性能。

　　从伊斯坦布尔Kayisdagi (N 40°58′26”;东经29°9′19”)。菌株经16S rRNA基因测序(1472 bp)鉴定，提交给NCBI, Genbank登录号为KF684939。该菌株首先从土耳其分离出来。

　　Luria Bertani肉汤来自Sigma-Aldrich。所有分析级化学品、表面活性剂和金属均购自Sigma、Himedia、ISOLAB chemicals、Merck和Neogen。液体洗衣液是从当地制造商Seba Kimya San采购的。作为。使用ELGA PureLab水系统制备溶液和缓冲液。

　　将大肠杆菌1.2.3保存在10%营养肉汤和10%甘油的原液中。在50ml Erlenmeyer烧瓶中加入10ml Bertani (Luria Bertani)肉汤培养基，然后在LB琼脂上划线。碱性蛋白酶的生产采用基础培养基含量(g/L): 0.5;葡萄糖,1.5;酪蛋白,2;Na2SO4, 1;MgSO4.7H2O 0.5;KH2PO4 0.5;K2HPO4。调节培养基pH至7.5。该培养基加入%1 (v/v)的接种剂，在轨道激振器中以150 rpm的转速在37°C下孵育过夜。

　　使用冷冻离心机(Allegra x-30r, Beckman Coulter, USA)，在4°C下，14000 rpm离心10分钟，将无细胞上清从过夜培养物中分离出来。该上清液用50%硫酸铵在4°C下沉淀(Maruthiah et al. 2013)。裂解液悬浮在0.1 M Tris-HCl缓冲液中，pH为8.2。该沉淀物用于酶稳定性研究和在洗涤剂洗涤过程中的应用。

　　采用Hammami et al.(2017)的改进方法估算蛋白酶活性。当蛋白酶分解酪蛋白时，它会释放出各种肽片段，包括氨基酸酪氨酸。游离酪氨酸的存在触发了与福林试剂的反应，导致形成可测量的蓝色产物。使用BioTek Synergy Neo2多模分光光度计(Agilent, USA)在660 nm处定量该产品的吸光度。为了评估蛋白水解活性的程度，建立了使用酪氨酸标准的校准曲线来确定游离酪氨酸的数量(Beg和Gupta 2003;Senthilkumar et al. 2005)。

　　用100μL粗酶和150μL 1% (w/v)酪蛋白作为底物，在0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)中测定蛋白水解活性。酶与底物的混合物在37℃下孵育30 min，加入650μL 1.2 M三氯乙酸(TCA)终止反应。阴性对照(空白)采用底物与TCA的混合物。将待测样品和空白样品放入冰浴中消除沉淀，8200 rpm离心10 min。离心后，将各待测样品和空白样品的上清液600μL与0.5N Bradford试剂混合充分。在660 nm处测定吸光度，根据酪氨酸标准图测定单位蛋白酶活性。用去离子水和0.18 mg/mL的l -酪氨酸原液精心配制了浓度为5 ~ 50 μg/mL的酪氨酸标准溶液。在pH 8.2和37°C条件下，在1分钟内从酪蛋白中释放1 μ mol(181μg)酪氨酸所需的酶制剂量被确定为蛋白水解活性的单个单位。

　　在温度为40°C、pH范围为3.0 ~ 12.0的条件下研究了pH对蛋白酶活性的影响。粗酶在40°C下孵育1小时，使用不同的缓冲溶液评估pH稳定性。剩余的酶活性在标准分析条件下进行评估。使用以下缓冲系统精确:100 mM醋酸酯缓冲液覆盖pH 3.0至6.0;100mm磷酸钠缓冲液，pH 7.0;100 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0;100mm甘氨酸- naoh缓冲液，pH范围为9.0 ~ 11.0;和100毫米氯化钠缓冲液，pH值为12至13。

　　在20°C到80°C的范围内分析温度的影响，测量pH值为10时的蛋白酶活性。将酶制剂暴露在30°C至60°C的不同温度下120分钟，以监测热稳定性。在特定的时间间隔，提取样品，并使用酶分析条件对其残留活性进行量化-未加热的粗酶作为对照，指示100%的活性。

　　通过在反应混合物中引入二价(Co2 +、Ca2 +、Cu2 +、Fe2 +、Mn2 +、Mg2 +、Ni2 +、Zn2 +)、一价(Na +和K +)金属离子和抑制剂(苯基甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA))，探讨了不同金属离子(5 mM)对蛋白酶活性的影响。无金属离子的活性为100%的基线。

　　通过在30°C条件下初步孵育1小时，考察了某些表面活性剂(SDS、吐温-80、TritonX-100)和氧化剂(过氧化氢、次氯酸钠、过硼酸钠)对酶稳定性的影响。剩余蛋白酶活性在pH 10条件下测定。在不添加任何添加剂的情况下，在类似的条件下，粗酶的活性为100%。

　　水洗性能方面，采用自制的高温仪。tergotometer是一种实验室规模的多重洗涤设备，用于评估洗涤剂成分，如香水、香料、肥皂、洗涤剂、染料和表面活性剂。该设备复制了基于搅拌器的洗衣机的动作，在其六个指定的烧杯(洗涤容器)内进行洗涤过程，同时保持控制温度和搅拌速度的条件。每个储液器的容量为1000 mL。温度最高可调至80°C，转速(rpm)在10至300 rpm范围内可调。在本研究的背景下，tergotometer的搅拌器转速设置为80 rpm，温度调节为30°C，并使用完整的1000 mL容量。温度计实验包括使用污迹布和干净的压舱布。

　　在洗涤过程中，使用蛋白酶特异性染色织物:EMPA 111(染血棉)，EMPA 116(染血/牛奶/墨水棉)和EMPA 117(涤/棉，65/35，染血/牛奶/墨水)。将粗酶分别加入0.5 g/L和1 g/L的无酶超白洗衣液中。同时，在洗涤条件下仅添加粗酶(1 g/L)，考察其单独效果。阳性对照采用含蛋白酶和其他酶的市售超白洗涤剂。

　　每个储层包含三个染色织物和一条10 × 10厘米的毛巾。洗涤时间设定为40分钟。洗涤后，染色织物在1升自来水中冲洗10分钟。冲洗后，所有污渍在环境温度下风干。将干燥的污渍熨平，并使用柯尼卡美能达CM-700d分光光度计进行读数。未处理的染色织物被视为基线参考，洗涤后染色强度的减少被量化为百分比，使用所提供的公式:

　　ΔE计算洗涤和未洗涤布料之间的颜色差异，而ΔE0评估标准干净布料样品与洗涤前织物之间的差异。SR指的是去污率。

　　在不同的时间间隔、pH值、温度和抑制研究中，蛋白酶活性的数据使用均值、标准差和方差分析来评估其重要性。测定了不同时间间隔的生长与酶活性的相关性。p值小于0.05。所有实验都是独立进行的，一式三次。

　　摘要。

　　介绍

　　材料与方法

　　结果与讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　缩写

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　大肠杆菌(E. indicum) 1.2.3是新从土壤样品中分离到的一种产生高度稳定碱性蛋白酶的菌株，经16S rRNA基因测序鉴定。按酪氨酸标准测定蛋白酶活性。在基础培养基中测定了最大生长速率和酶活性。蛋白酶活性和细胞质量增加，直至对数期20 h(图1)。在固定期开始时，蛋白酶活性达到最大水平。随着培养进入后期固定阶段，由于营养物质的限制、细胞有毒废物的增加和培养基中蛋白酶的产生，蛋白酶活性和细胞质量开始下降。在Hakim等人(2018)的研究中也观察到了类似的结果，他们发现了基于肠杆菌的蛋白酶活性的相同概况。

　　图1

　　

　　酵母1.2.3的生长曲线和蛋白酶活性谱。所有实验均为三次重复，均计算出平均标准差

　　发现这种细菌酶在不同环境条件下的蛋白质水解能力对工业应用具有重要意义。

　　E. indicum 1.2.3在pH 3 ~ 12之间表现出蛋白酶活性。在pH值为10的碱性条件下观察到最佳活性(图2a)。在pH值为10时获得了相对的pH稳定性，在120分钟内保持了90%以上的活性，在pH值为9、11和12时，保持了70%以上的活性(图2b)。这一结果与以往的研究结果一致，表明在碱性条件下，肠芽孢杆菌产生的蛋白酶量最大。大肠杆菌AKAL 11菌株在最适pH值为9时蛋白酶活性最高。另一株大肠杆菌TBG-PICH-001在pH为10时产生最大蛋白酶(Hakim et al. 2018;Kumar et al. 2018)。

　　图2

　　

　　pH对蛋白酶活性(a)和稳定性(b)的影响

　　高pH范围的稳定性增加了不同行业的潜在应用，如皮革、纺织和废水处理(Li et al. 2013;Sani et al. 2017;Sun et al. 2019)。

　　碱性特征蛋白酶在100 mM甘氨酸- naoh缓冲液中，在30°C、pH 10条件下活性最高。蛋白酶在20 ~ 30℃之间表现为热活化。在40 ~ 50℃间，剩余蛋白酶活性保持在75 ~ 85%左右。在60°C以上，蛋白酶发生热失活(图3a)。

　　图3

　　

　　温度对蛋白酶活性(a)和稳定性(b)的影响

　　根据剩余蛋白酶活性，在30,40和50°C下进行180 min的热稳定性测试。在30℃条件下，蛋白酶活性保持3 h，对洗衣环境等施用条件有积极影响。在40°C条件下，酶活性在超过80%的情况下持续2小时。最后，在50°C条件下，蛋白质水解能力在60%左右保持1小时，然后在90分钟后下降到50%以下(图3b)。

　　Suwannaphan等人(2017)表明碱性丝氨酸蛋白酶具有类似的活性热分布范围。用籼稻AKAL 11和深稻BK-P23获得的结果几乎相同，最适温度为30°C (Anbu et al. 2013;Hakim et al. 2018)。

　　E. indicum 1.2.3产生对精神有影响的蛋白酶，对低温洗涤剂工业至关重要。在较低的温度下洗涤可以使织物得到护理，并且衣服看起来更耐用。此外，低温在无加热水的帮助下节省了能源，这对环境有重要影响(Laitala和Jensen 2010;Vojcic et al. 2015)。

　　通过对不同金属离子的反应，有效地评价了蛋白酶的活性。图4的结果表明，在1 mM处添加二价Ca2+， Mn2+， Ni2+， Cu2+和Mg2+，与不添加金属离子相比，E. indicum 1.2.3的蛋白水解活性分别显著提高了47%，25%，24%，17%和15%。这些发现表明，离子在保持酶的活性构象中起着至关重要的作用。这些结果与Hammami等人(2018)的文献相似，他们发现Ca2+、Mn2+和Mg2+分别使蛋白酶活性提高了56%、38%和23%。

　　图4

　　

　　金属离子和抑制剂对蛋白酶活性的影响

　　相反，Fe+2、Co+2和Na+对籼稻1.2.3酶活性的影响分别为24%、18%和11%。Suwannaphan等人(2017)报道，添加Fe2+导致丝氨酸蛋白酶相对活性下降近45%。

　　在抑制筛选中，PMSF在1 mM处完全抑制酶的活性，表明该酶是一种丝氨酸蛋白酶，其活性位点有丝氨酸残基。EDTA部分抑制蛋白酶活性，表明底物水解需要金属离子。

　　E. indicum 1.2.3蛋白酶在氧化剂存在下进行检测，结果见图5。经过1小时的孵育，即使在1%阴离子表面活性剂(SDS)的存在下，粗酶制剂仍保持了94%以上的剩余蛋白水解活性。Ghorbel等人(2014)的发现得到了证实，在0.5% SDS的存在下，黄褐链霉菌HS1A将剩余蛋白酶活性提高到18.6%。此外，Gupta等人的研究表明，来自mojavensis芽孢杆菌的蛋白酶在1%的SDS中也是稳定的。

　　图5

　　

　　表面活性剂和氧化剂对蛋白酶活性的影响

　　在非离子型表面活性剂的作用下，Tween 80和Triton X-100添加1%后，粗蛋白酶活性显著提高，分别为初始活性的140%和110%。Suwannaphan等人(2017)提出，在0.5和1%的Tween 20、Tween 80和Triton X-100存在下，蛋白酶活性不受影响，并显示出80%以上的活性。

　　在氧化剂的存在下，测试了蛋白酶的稳定性。该蛋白酶在1%次氯酸钠(> 75%)、过氧化氢(> 90%)和过硼酸钠(> 105%)中表现出高度稳定的活性。该蛋白酶的特性可为在洗涤剂配方中使用抗氧化剂酶提供机会。在一项研究中，来自铜绿假单胞菌的蛋白酶与氧化剂表现出良好的相容性(grbav

　　iki et al. 2011)。Hammami等人(2017)发现过硼酸钠不影响蛋白酶活性。

　　对氧化剂和SDS稳定的酶在野生型微生物中是罕见的。

　　基于酶的洗涤剂现在使用rDNA和蛋白质工程来创造更稳定和高效的生物工程酶。突变使得蛋白酶制剂更适合不同的洗涤条件，并能抵抗高温和氧化剂(Beg and Gupta 2003)。

　　随着城市化进程的推进，洗涤剂工业不断发展，配方需要更特异、更强效的酶。通过在低温(30℃)下洗涤蛋白酶敏感标准污渍EMPA 111(染血棉)、EMPA 116(染血/牛奶/墨水棉)、EMPA 117(65/35，染血/牛奶/墨水棉)来测试酶作为洗涤剂添加剂的效果。洗涤试验结束后，用织物专用分光光度计测定染色去除率。结果如图6所示。结果表明，与仅使用洗涤剂或仅使用酶相比，蛋白酶在洗涤剂配方中对污渍非常有效。通过对市售超白洗衣粉洗涤性能的比较，表明籼米1.2.3蛋白酶具有进一步研究的前景。

　　图6

　　

　　洗涤剂配方中的酶洗性能

　　根据洗涤结果，只有洗涤剂的性能受到限制，因为缺乏酶。0.5 g/L和1 g/L含酶制剂的去污率分别为> 80%和> 85%。在之前的一项研究中，来自E. indicum AKAL 11的碱性蛋白酶与不同的商业洗涤剂溶液表现出良好的相容性(Emon et al. 2020)。然而，在本研究中，没有任何洗涤性能的研究。

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